说一说尿路上皮分化有关的特异糖蛋白Uroplakin

一、尿路上皮不对称单位膜(AUM)的发现

20世纪60年代初，用电子显微镜对尿路上皮的超微结构观察发现尿路上皮的腔表面细胞膜上覆盖着许多直径0.3～0.5μm的脂样斑块。在膀胱扩张时，胞浆内的囊泡与膀胱腔表面的斑块相融合可扩大膀胱的表层面积，有效地防止了因膀胱扩张而引起的尿路移行上皮的破损。在膀胱收缩时，此斑块可以融合为囊泡形式存在于胞浆内。推测此斑块在稳定膀胱的功能中起重要作用。高倍电镜显示，胞膜上的这些斑块表现为不对称单位膜(AUM)，即斑块的腔表面厚度(8nm)约是胞浆内层厚度(4nm)的2倍，表现为内外层厚度的不对称性。将分离的斑块进行冷冻蚀刻和负染色显示，腔表面由致密的、半晶体样的、六角形微粒构成，微粒直径16nm，以二维晶体结构存在。进一步研究发现一个微粒可再分成6个哑铃形亚单位，每个亚单位可再分成外层和内层球形的亚区。据推测，每个哑铃形的亚单位可能需相对分子质量49 000的蛋白组成[2]。

二、AUM的蛋白组成-UPs

20世纪70年代，人们开始对AUM的蛋白组成进行研究[2]。先是从细胞骨架中用洗脱剂“分离”AUM并用琼脂糖梯度离心方法进行纯化。用这种方法分离的AUM蛋白经SDS-PAGE分析，发现其相对分子质量差异很大。又因没有针对这些蛋白的抗体，无法检测分离的这些蛋白就是构成AUM的蛋白。直到1990年，Yu等[3]应用免疫学方法生产出鼠抗牛AUM的单克隆抗体AE31，免疫电镜证明它能识别位于AUM腔表面的27 000糖蛋白，为研究AUM蛋白组成提供了有效方法。应用改良的琼脂糖密度梯度离心方法和免疫学方法，Wu等[2]生产了毫克数量级的纯牛AUM并获得了其相应的兔抗牛多克隆抗体，证明AUM由三种蛋白构成即15 000(UPⅡ)、27 000(UPⅠ)和47 000(UPⅢ)。免疫电镜证实了这三种蛋白都是尿路上皮特异的AUM相关蛋白。后来发现UPI和UPⅡ主要位于AUM的腔面，而UPⅢ则分布在AUM的腔面和胞浆内，提示UPⅢ是一个跨膜结构。UPⅢ的合成是经由经典的粗面内质网/高尔基体途径，而不是象以前人们推测的由游离多聚体合成。脱糖基和cDNA序列分析显示，UPⅢ由20 000和N端联结的糖基与28 900的核心蛋白组合而成。成熟的UPⅢ蛋白是单一的跨膜蛋白，跨膜蛋白将UPⅢ分子分成长的膜外N末端(20 000，由189个氨基酸构成，含N-糖基化位点和半胱氨酸残基)和短的胞内C末端(5 000，由52个氨基酸组成，有丰富的磷酸化位点)。研究显示UPⅢ是仅有的一个有突入胞浆内的末端，提示它可能在AUM与细胞骨架的相互作用中起重要作用。从构成上看，UPⅢ的细胞外区域远远超过细胞内区域，这种细胞内外不对称的分布方式，与UPI和UPⅡ共同构成了AUM的分子基础[4]。

牛UPI的cDNA克隆显示UPI存在着2个同形异构体，一个是27 000的UPIa，另一个是28 000的UPIb，二者氨基酸序列有39%的同源性且均为有4个跨膜区的蛋白质，每个蛋白均有2个亲水环暴露于腔面，环内有6个高度保守的半胱氨酸残基。UPIa和UPIb同属于有4个跨膜区的蛋白超家族[5]。

超微结构显示AUM的外层由16nm的微粒形成二维晶体结构，而每个微粒形成“扭曲的缎带”结构[6]。组成AUM的4个蛋白质中，UPIa和UPIb均有4个跨膜区，UPⅡ和UPⅢ均只有1个跨膜区。UPIa/UPⅡ与UPIb/ UPⅢ相组合形成2个生化组成不同但直径均为16nm的AUM微粒[7,8]。

AUM形成的脂样斑块覆盖了伞状细胞表面的70%以上。连结这些脂样斑块的浆膜被认为有特殊的功能即是一种柔软而有韧性的“链”。Yu等[9]设计了一种新的抗体AE32，它能识别85～100 000(命名为UGP85)的尿路上皮特异的糖蛋白。在正常上皮和培养的尿路上皮集落，UGP85持续在表层表达，提示它是分化特异的糖蛋白。体外实验证实此蛋白含有55 000的核心多肽。用免疫金技术证明在培养的尿路上皮集落中(没有成熟的AUM斑块)，UGP85分布在分化较好的细胞表面。而在正常尿路上皮的表层细胞，UGP85主要在链区。说明UGP85是一个胞膜成分，它存在于连结AUM的链区。

综上所述，构成尿路表层上皮细胞膜的主要蛋白成分已明了，它们是构成AUM的UPIa、UPIb、UPⅡ和UPⅢ四种蛋白和构成链区的UGP85共5种蛋白。

三、UP的高度保守性

UP是高度保守的糖蛋白。Wu等[10]分离了除牛以外的8种哺乳动物膀胱表层的AUM即人、猴、羊、猪、狗、兔、大鼠和小鼠，发现这些种属的AUM在形态上很相似，均由直径12nm的蛋白微粒构成，两个微粒的中心距离16.5nm。用抗牛UP的抗体进行免疫杂交显示所有种属的AUM均有UPIa、UPIb、UPⅡ和UPⅢ四种蛋白。牛和小鼠的UPⅡ的氨基酸序列有83%的同源性。这些结果提示UPIa、UPIb、UPⅡ和UPⅢ可能是所有哺乳类尿路上皮脂样斑块的主要蛋白成分，UP分子的序列分析和三维结构在哺乳类动物进化过程中高度保守[10]。

四、UP基因及其蛋白产物的应用研究

(一)UP基因与生物制药

Lin等[11]首先克隆了小鼠UPⅡ基因，它位于11q23染色体，并用此基因的3.6kb 5’端上游序列与一种细菌的lacZ基因(表达β-半乳糖甙酶)融合，在转基因鼠的尿路上皮表层获得了特异性表达，其表达方式如同小鼠内源性UPⅡ基因表达一样。而在转基因鼠的非尿路上皮没有表达，包括皮肤、食道、小肠、心脏和肾实质。这说明小鼠UPⅡ基因3.6kb的5’上游序列已包含了足够的UPⅡ基因的信息，它可以导入并启动外源性基因在转基因小鼠的膀胱表层上皮内获得特异性和分化依赖性的表达。随后，Kerr等[12]应用微注射的方法将含有小鼠3.6kb UPⅡ基因启动子的UPⅡ-hGH(人生长激素)融合基因注射到小鼠受精卵中产生转基因鼠，此鼠膀胱上皮表达人生长激素。鼠尿中hGH浓度可达100～500ng/ml，且可持续8个月。说明膀胱可以作为生物反应器产生人们所需要的异源性蛋白质，为生物制药提供了新的方法。

(二)UP在尿路上皮分化和癌变中的应用

牛尿路上皮细胞在3T3细胞存在的情况下培养可形成复层上皮集落，通过分析细胞角蛋白和UPI的表达可判断细胞的分化状态。研究表明培养的尿路上皮细胞大量合成K5、K6细胞角蛋白，同时还表达UPI蛋白，说明尿路上皮已向成熟的伞状细胞分化[13]。正常尿路上皮基底细胞和中间层表达CK17而表浅层细胞表达UP和CK20。用糖精诱发小鼠尿路上皮细胞损伤后，再生的尿路上皮可继续向正常尿路上皮分化，在分化不完全时同样表达CK17而分化完全的细胞则表达CK20和UP，且伴有相应的超微结构改变。说明再生的尿路上皮在分化过程中有CK表达的变异和UP的出现，UP是尿路上皮细胞分化的标志蛋白[1,14]。

Zhang等[15]把转染了SV40T致癌基因的UP基因导入小鼠体内作成转基因鼠模型，发现SV40T在小鼠膀胱中特异表达且可导致膀胱原位癌(Cis)的发生，SV40T的拷贝数越高越容易诱发膀胱Cis和浸润癌及转移。提示Cis是浸润性移行细胞癌的前体，首次证明膀胱癌的致癌过程经由两条不同的途径：乳头状癌和Cis/浸润癌。UP基因是研究膀胱癌发生发展和致癌因素的非常好的载体。

(三)UP在膀胱癌临床中的应用

Moll等[16]用免疫组织化学方法，应用兔抗UPⅡ和UPⅢ抗体检测了UP蛋白在人类不同肿瘤的表达情况，结果88%(14/16)的乳头状非浸润性移行细胞癌、53%(29/55)的浸润性移行细胞癌、66%(23/35)转移的移行细胞癌有UPⅢ的表达。染色类型包括表层膜染色(见于乳头状癌)、微囊染色(见于乳头状癌和浸润癌)、细胞巢周围染色(见于浸润癌)和细胞浆及细胞间染色。177例各种各样的非移行细胞癌均无UP表达，包括膀胱鳞状细胞癌[17]。进一步研究显示膀胱移行细胞癌UP表达与膀胱癌的分化程度有相关性，膀胱癌分化越好UP的表达比例越高[18]。说明UP是尿路上皮高度特异的的标志性蛋白，对不明来源转移癌的鉴别有重要的诊断价值。

Yuasa等[19]和Li等[20]用RT-PCT方法分别检测了膀胱癌患者血中UP的表达情况，发现有转移的膀胱癌患者血中UP阳性率分别为100%(3/3)和30%(3/10)，而在正常人和无转移的膀胱癌患者外周血中则检测不到UP基因。检测的敏感性是5ml外周血中只要有一个癌细胞则RT-PCR结果即为阳性。有转移癌而未接受化疗的患者比接受化疗的更容易检测到阳性结果(2/2比1/8)。提示外周血检测UP基因对判断膀胱癌的血行播散及转移有应用价值，同时还可用于检测对膀胱癌化疗的反应效果及判断膀胱癌的分期。

(四)UP与泌尿系感染

泌尿系感染最常见的细菌是大肠杆菌(E.Coli)。研究表明E.Coli有两个表面抗原：P-伞状抗原和1型伞状抗原。P-伞状抗原可识别肾的糖脂受体而致肾盂肾炎。而1型伞状抗原可通过受体特异识别尿路上皮表层细胞的UPIa和UPIb，使细菌停留于尿路上皮表面。E.Coli从膀胱沿尿流逆行至输尿管和肾脏可引起泌尿系感染。UPIa、UPIb与E.Coli通过受体的结合为认识泌尿系感染的病原及致病过程提出了强有力的证据[21]。

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